در سال زراعی 1375، در یکی از مزارع سیب زمینی در بجنورد تعداد زیادی بوته سیب زمینی که دارای علایم کوتولگی، رنگ پریدگی و موزاییک خفیف بودند نشانه گذاری شد. هنگام برداشت محصول، از هر بوته نشانه گذاری شده تعدادی غده جمع آوری نموده و تا سپری و شکسته شدن دوره خواب، در سردخانه تاریک با دمای چهار درجه سانتی گراد نگهداری شد. بعد از اتمام دوره خواب، غده ها در خاک معمولی زراعی کاشته و در گلخانه با دمای تقریبی 25-20 درجه سانتی گراد نگهداری شدند. مطالعات دامنه میزبانی، آزمون های ساندویچ دو طرفه الیزا(direct double - antibody sandwich enzyme - linked immunosorbent assay; DAS - ELISA)، نقطه گذاری روی غشا نیتروسلولز (dot immunobinding assay; DIBA) و میکروسکوپ الکترونی نشان داد که بوته های حاصله از رشد غده های مذکور، آلوده به ویروس X سیب زمینی (Potato Virus X, PVX) هستند. مایه زنی از برگ های دارای علایم به گیاهان آزمون، منجر به بروز علایم سیستمیک در Nicotiana glutinosa، N. debenyi، N. tabacum cv. Turkish، N. tabacum cv. Xanthi، N. tabacum cv. Samsun، Datura stramonium، Lycopersicon esculentum و Capsicum frutescens شد در حالی که در Chenopodium amaranticolor، C. quinoa و Gomphrena globosa علایم موضعی ظاهر شد و در Cucumis sativus هیچگونه علایمی مشاهده نگردید. از N. glutinosa جهت تکثیر و خالص سازی ویروس استفاده شد و سپس آنتی سرم علیه ویروس خالص شده تهیه گردید. به منظور بررسی ویروس X سیب زمینی در شمال خراسان، از 26 مزرعه در مناطق بجنورد، چناران، شیروان، طوس، فاروج و قوچان مجموعا 247 بوته بطور تصادفی نمونه برداری و از آزمون ساندویچ دو طرفه الیزا جهت تشخیص این ویروس در آنها استفاده شد. نتایج این آزمون نشان داد که مناطق فوق به ترتیب 50، 63.6، 34.7، 53.3، 62.8 و 37.2 درصد آلودگی دارند.

این پژوهش به منظور غربالگری برخی ژنوتیپ های سیب زمینی شامل 35 رقم تجاری در ایران و 24 کلون امیدبخش حاصل از برنامه های به نژادی، نسبت به ویروس X سیب زمینی (Potato virus X = PVX) با استفاده از آزمون های بیولوژیکی و نشانگرهای مولکولی انجام شد. برای این منظور، ابتدا جدایه ویروسی روی گیاه محک گل تکمه ای مایه زنی و خالص سازی بیولوژیک و سپس با مایه زنی روی گیاه توتون، تکثیر و در محیط کشت بافت نگهداری گردید. برای ارزیابی واکنش ژنوتیپ ها نسبت به این ویروس از روش استاندارد مرکز بین المللی سیب زمینی(CIP) شامل مایه زنی مکانیکی و پیوند استفاده شد. ابتدا سه گیاهچه سیب زمینی از هر ژنوتیپ به صورت مکانیکی در شرایط گلخانه ای توسط عصاره آلوده به ویروس مایه زنی شد و ژنوتیپ ها براساس نتایج آزمون DAS-ELISA در دو گروه مقاوم و حساس قرار گرفتند. به منظور تعیین نوع مقاومت ژنوتیپ های مقاوم بر روی گیاهان گوجه فرنگی آلوده به PVX در سه تکرار پیوند و آلودگی آنها توسط آزمون الایزا بررسی شد. نتایج حاصل از هر دو آزمایش مایه زنی مکانیکی و پیوند نشان داد که 12 رقم تجاری و 11 کلون امیدبخش سیب زمینی دارای مقاومت از نوع بسیار بالا (Extreme Resistance, ER) و 9 رقم تجاری و یک کلون امیدبخش دارای مقاومت از نوع فوق حساسیت (Hypersensitive Reaction, HR) نسبت به PVX بودند. سایر ژنوتیپ ها شامل 14 رقم تجاری و 12 کلون امیدبخش در حداقل یکی از تکرارها به PVX آلوده شدند و به عنوان حساس شناسایی گردیدند. غربالگری برای ژن های مقاومت Rx1 و Rx2 نیز توسط واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR) به ترتیب با استفاده از نشانگرهای اختصاصی 5RX1 و106RX2 در ژنوتیپ های با مقاومت ER انجام شد. نتایج بررسی های مولکولی نیز نشان داد که 13 ژنوتیپ سیب زمینی دارای ژن مقاومت Rx1 و هفت ژنوتیپ دارای ژن مقاومت Rx2 بودند و در ژنوتیپ های با مقاومت HR و حساس هیچیک از این ژن ها ردیابی نشد و با نتایج آزمایش های گلخانه ای و سرولوژیکی مطابقت داشت. با توجه به نتایج این پژوهش از ژنوتیپ های با مقاومت ER به ویروس و دارای ژن Rx1 و یا Rx2 می توان در برنامه های به نژادی به عنوان والد مقاوم برای تولید ارقام سیب زمینی با صفات مطلوب زراعی و مقاوم نسبت به PVX استفاده کرد.

اهداف: ویروس X سیب زمینی (PVX) از خانواده Alphafl exiviridaeو جنس Potexvirus یکی از رایج ترین و گسترده ترین ویروس های آلوده کننده سیب زمینی در جهان می باشد. به دلیل گسترش و خسارت اقتصادی این ویروس در ایران، شناسایی و ردیابی آن با استفاده از روش های با صرفه تر ضروری می باشد. تولید آنتی بادی چندهمسانه ای با استفاده از فناوری دی اِن اِی نوترکیب، یک راهکار مفید برای تسهیل شناسایی این ویروس در طبیعت می باشد. مواد و روش ها: بر این اساس، در بررسی حاضر، یک نمونه سیب زمینی آلوده به PVX از مزارع سیب زمینی در زرند، استان کرمان جمع آوری و آلودگی آن نسبت به ویروس مذکورتوسط آزمون DAS-ELISA تایید گردید. جدایه مذکور جهت تکثیر، بر روی توتون (Nicotiana glutinosa) مایه زنی گردید. پس از استخراج آر اِن اِی از گیاه آزمون، با استفاده از واکنش RT-PCR و آغازگرهای اختصاصی حاوی جایگاه برش برای آنزیم های برشی، توالی پروتئین پوششی ویروس تکثیر و در ناقل بیان پروکاریوتی (pQE60) همسانه سازی گردید. پلاسمید نوترکیب، به باکتری Escherichia coli سویه M15، منتقل شد. نتایج: پس از القای بیان، پروتئین مورد نظر استخراج و با تکنیک SDS-PAGE در ژل پلی آکریلامید 5/12 % مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل بیانگر آن است که وزن مولکولی باند حاصله در آزمون SDS-PAGE با وزن مولکولی پروتئین پوششی (kDa 24) مطابقت دارد. همچنین بیان پروتئین پوششی ویروس در تکنیک دات بلات نیز تأیید گردید. نتیجه گیری نهایی: در این تحقیق، یک آنتی ژن نوترکیب مناسب جهت تشخیص ویروس X سیب زمینی تهیه گردید که به-خوبی توسط آنتی سرم تولید شده از طریق تزریق پیکره های کامل ویروس به خرگوش در آزمون دات بلات شناسایی شد. تولید آنتی بادی چندهمسانه ای با استفاده از آنتی ژن ویروسی نوترکیب، گامی موثر در زمینه تسریع و تسهیل فرآیند شناسایی سرولوژیکی نمونه های آلوده به این ویروس مهم خواهد بود.

ویروس های PVY و PVX از مهمترین ویروس های بیماری زا در مزارع سیب زمینی دنیا به شمار می روند. هدف از این تحقیق، خالص سازی این دو ویروس از گیاهان آلوده به منظور تهیه یک سیستم سرولوژیکی تشخیص سریع می باشد. بدین منظور ویروس های PVY و PVX از بوته های آلوده مزارع سیب زمینی استان خوزستان جدا و در شرایط گلخانه در گیاه توتون سامسون Nicotiana tabacum L.cv. Samsun بطور جداگانه تکثیر شدند. پس از خالص سازی ویروسها، با تزریق آموده های (پرپاراسیون ها) خالص ویروس به خرگوش، آنتی سرم تهیه شد. علاوه بر کاربرد آنتی سرم های تهیه شده در آزمون های مختلف نشت در آگار، ملکول های گاماگلوبولین (LgG)G آنتی سرمهای بدست آمده نیز خالص شده و در آزمون های الایزا (ELISA) و دیبا (DIBA) به طریق غیرمستقیم بکار برده شدند. نتایج بدست آمده نشان داد که سیستم های سرولوژیکی الایزا (ELISA) و دیبا (DIBA) تهیه شده در این تحقیق آلودگی به دو ویروس PVY و PVX را به خوبی در گیاهان سیب زمینی تشخیص می دهند.

سیب زمینی به وسیله ویروس های مختلفی آلوده می شود که می توانند عملکرد را کاهش دهند، ویروس X سیب زمینی (PVX) به لحاظ اقتصادی یکی از ویروس های مهم این محصول است. روش های متعددی شامل آزمون های سرولوژیکی و مولکولی جهت تشخیص این ویروس وجود دارند، اما این روش ها زمان بر بوده و نیازمند ابزارهای پیچیده ای هستند. هدف از این پژوهش، کاهش زمان مورد نیاز جهت تشخیص PVX با استفاده از روش IC-RT-LAMP بود. نمونه های برگی (50 نمونه) با علایم مشابه به ویروس X سیب زمینی از سطح استان کردستان جمع آوری و برای آزمون سرولوژیکی (DAS-ELISA) به کارگرفته شدند. واکنش IC-RT-LAMP به صورت یک مرحله ای (بدون نیاز به استخراج RNA)، تحت شرایط هم دما انجام شد و نتایج به وسیله الکتروفورز بر روی ژل آگارز و رنگ هیدروکسی نفتول بلو (HNB) ارزیابی شد. نتیجه مثبت استفاده از رنگ HNB تغییر رنگ مخلوط واکنش از بنفش به آبی آسمانی بود. از مزایای روش IC-RT-LAMP در مقایسه با سایر روش های پیشین می توان به اختصاصیت بالا، حساسیت بالا، سرعت بالا، کارآیی بالا، ایمنی، سهولت، عدم نیاز به تجهیزات پر هزینه جهت تکثیر، عدم نیاز به استخراج RNA، عدم نیاز به کارهای تشخیصی بعد از تکثیر، تشخیص مشاهده ای و کاربر دوستی آن اشاره کرد.

از میان بیمارگرهای ویروسی، ویروس برگ قاشقی سیب زمینی و ویروس وای سیب زمینی در اغلب مناطق تولید سیب زمینی ایران، خسارت اقتصادی به محصول وارد می نمایند. این پژوهش با هدف بررسی میزان آلودگی مزارع تولید بذر سیب زمینی در مناطق مختلف استان همدان به ویروس برگ قاشقی و ویروس وای سیب زمینی و نیز ارزیابی حساسیت ارقام مختلف مورد مطالعه به ویروس های مذکور انجام شد. برای این منظور از کلیه مزارع تکثیر بذر سیب زمینی کلاس بذری S در استان همدان که بر اساس استانداردهای ملی تولید بذر این محصول دارای فاصله ایزولاسیون 400 متر و تناوب 3 ساله بودند، نمونه برگی تهیه شده و از طریق آزمون ساندویچ دو طرفه الایزا و آزمون آی سی-آرتی-پی سی آر آلودگی نمونه ها به ویروس های مورد مطالعه تعیین شد. نتایج نشان داد که در منطقه کبودرآهنگ آلودگی به هر دو ویروس وجود دارد، در حالی که در دو منطقه دیگر مورد مطالعه (گل تپه و رزن) آلودگی به ویروس برگ قاشقی و ویروس وای سیب زمینی دیده نشد. در منطقه گل تپه که منطقه عاری از بیماری های مورد مطالعه بود، شرایط اقلیمی برای فعالیت و تکثیر ناقلین بیماری های ویروسی نامطلوب بوده است بدین ترتیب که میانگین دمایی و میزان بارندگی در این منطقه نسبت به مناطق دیگر مورد مطالعه پایین تر بود. از بین ارقام مورد مطالعه ارقام آگریا و آریندا به هر دو ویروس مورد مطالعه آلوده شدند در حالی که آلودگی به ویروس برگ قاشقی و ویروس وای سیب زمینی در ارقام سانته، بانبا و جلی مشاهده نشد. آلودگی به ویروس برگ قاشقی و ویروس وای سیب زمینی عملکرد رقم آریندا را کاهش داد در حالی که عملکرد رقم آگریا تحت تاثیر آلودگی به ویروس های مورد مطالعه قرار نگرفت.

بیماری برگ قاشقی سیب زمینی یکی از مهم ترین و شایعترین بیماری های ویروسی سیب زمینی است و مانند سایر ویروس های بیماری زای گیاهی مؤثرترین روش مبارزه با آن استفاده از ارقام مقاوم است. در این تحقیق واکنش تعدادی رقم و ژرم پلاسم سیب زمینی در برابر آلودگی به ویروس برگ قاشقی سیب زمینی (Potato leafroll virus= PLRV) در یک آزمایش مزرعه ای در قالب طرح بلوک های کامل تصادفی با 12 تیمار و سه تکرار ارزیابی شد. مایه زنی بوته ها ی سیب زمینی با استفاده از شته سبز هلو حامل PLRV صورت گرفت. یک ماه پس از مایه زنی، بوته ها از نظر آلودگی به PLRV با استفاده از علایم ظاهر شده و آزمون الایزا بررسی شد. نتایج نشان داد که بین ژنوتیپ های سیب زمینی مورد بررسی از نظر میزان ابتلا به PLRV اختلاف معنی دار وجود دارد. ژرم پلاسم شماره 13/803970 بدون هیچ گونه آلودگی به عنوان ژنوتیپ خیلی مقاوم به PLRV ارزیابی گردید. رقم سانته مقاوم بود، رقم لیدی رزتا و ژنوتیپ شماره 31/397015 نسبتاً مقاوم و رقم دیامانت نسبتاً حساس بود. مابقی ارقام و ژرم پلاسم ها حساس یا بسیار حساس ارزیابی شدند. همچنین نتایج بیانگر همبستگی معنی دار 79 درصدی بین میزان آلودگی بر مبنای ظهور علایم و میزان آلودگی بر مبنای آزمون الایزا بود.

ویروس S سیب زمینی (PVS) متعلق به جنس Carlavirus از تیره Betaflexiviridae یکی از ویروس های مهم خسارت زا در سیب زمینی می باشد. به منظور ردیابی ویروس S سیب زمینی، نمونه برداری از مزارع سیب زمینی استان اردبیل، طی تابستان سال های 95-1394، صورت گرفت. گیاهان محک در گلخانه، به منظور بررسی بیولوژیکی نمونه های برگی مشکوک به آلودگی، مایه زنی شدند. نمونه ها با آزمون الیزا از نظر آلودگی به ویروس PVS مورد بررسی قرار گرفتند. جهت ردیابی مولکولی، از روش RT-PCR با استفاده از آغازگرهای اختصاصی مربوط به ناحیه پروتئین پوششی ویروس PVS استفاده شد. توالی نوکلئوتیدی ژن پروتئین پوششی مربوط به دو جدایه از ویروس (با رس ‍ شمار MH159207 و MH159208) جدا شده از ارقام آگریا و اوشینا تعیین شد. توالی پروتئین پوششی دو جدایه با یکدیگر و با 29 جدایه دیگر قابل دسترسی در بانک ژن مقایسه شد. درخت تبارزایی رسم شده نشان داد که جدایه ها به دو گروه اصلی I (زیرگروه های IA وIB ) و II تقسیم شدند. دو جدایه Ag-9-PVS-F و Os-11-PVS-F در زیرگروه IB همراه با جدایه های آذربایجان، کرمان، همدان و اصفهان و جدایه هایی از مجارستان، اوکراین، اسکاتلند و هند قرارگرفتند. هم ردیفی توالی اسید آمینه فرضی پروتئین پوششی دو جدایه مورد بررسی با شش جدایه ایرانی و پنج جدایه خارجی این ویروس بیانگر اختلاف در هشت و 25 اسیدآمینه به-ترتیب برای جدایه های Ag-9-PVS-F و Os-11-PVS-F بود. نتایج نشان دهنده وجود جدایه های متنوع ویروس PVS در کشور بوده و تفاوت در توالی اسید نوکلئوتیدی و اسید آمینه ای می تواند حاکی از تفاوت در منشا جفرافیایی و به تبع آن نحوه و زمان ورود جدایه های ویروس به منطقه باشد.